Viktig pusselbit om orsaken till multipel skleros

Äggviteämnet alfa2-makroglobulin (alfa2-MG) har en viktig funktion att motbalansera för stark nedbrytning av olika ämnen i kroppen. I den aktuella avhandlingen visas att patienter med MS har en förändrad form av alfa2-MG. Denna har försämrad förmåga att hämma nedbrytning, vilket kan leda till ökad bildning av ämnen som kan delta i uppkomsten av MS

Disputationen
Lördagen den 17 mars försvarar Martin Gunnarsson vid Institutionen för klinisk mikrobiologi, Immunologi, Umeå universitet, sin avhandling med titeln: The conformational complexity of alpha2-macroglobulin and its relation to multiple sclerosis. Svensk titel: Alfa2-makro-globulins komplexitet och dess relation till multipel skleros. Disputationen äger rum kl. 13.00 i sal E04 vid Immunologiska avdelningen.

Multipel skleros - en sjukdom med speciell geografisk fördelning
Multipel skleros (MS) är en kronisk sjukdom med ännu okänd orsak, som ganska specifikt drabbar nervtrådarnas isolerande hölje, myelinet. MS drabbar främst unga och medelålders personer och kvinnor nästan dubbelt så ofta som män. Debuten inträffar hos flertalet mellan 10-50 års ålder, drygt 75% är mellan 20-40 år. Sjukdomen uppträder främst hos den vita, nordeuropeiska rasen. Risken för svarta i USA är endast 43% av den för vita och för asiater är den endast 27%. Sedan länge är det välkänt att MS mest förekommer i de tempererade zonerna, d.v.s. norra delen av norra halvklotet och södra delen av det södra. Före-komsten (prevalensen) för MS i de nordiska länderna är 50-130 per 100.000 personer. Orkneyöarna norr om Skottland har en prevalens på hela 309 per 100.000 personer. Nyinsjuknandet (incidensen) är i de nordiska länderna cirka 5 per 100.000 och år. Den speciella geografiska fördelningen kan få en att tro att klimatfaktorer och speciella infektioner ligger bakom. Detta stämmer inte alltid. Fördelningen av MS stämmer mycket väl med utbredningen av den ärftliga egenskapen, vävnadstypen HLA-DR2.

Multipel skleros - en sjukdom med okänd orsak
Trots intensiv forskning är orsaken till MS ännu okänd. Med jämna mellanrum dyker nya, mer eller mindre trovärdiga hypoteser upp. Tre ingredienser för uppkomsten är: ärftliga faktorer, infektioner och immunologiska reaktioner. Stöd för ärftlighetens betydelse finns från familje- och tvillingstudier. Om risken för MS normalt är 0.1% i Sverige är risken för ett syskon till en MS-sjuk 2%, för en tvåäggs-tvilling också 2% och för en enäggstvilling 30%. Det är troligt att flera arvsanlag (gener) är viktiga för att drabbas av MS. En av dessa sitter på kromosom 6 och ger upphov till vävnadstypen HLA-DR2. Om man har denna gen är risken att få MS 3-4 gånger större än om man saknar den. Att en infektion kan vara utlösande har mycket stöd men säkra bevis finns ännu inte. Bland de hetaste mikroorganismerna märks herpesvirus typ 6, HTLV-1 och chlamydia pneumoniae (TWAR).

Autoimmuna mekanismer kan ha stor betydelse
Man tror att hos ärftligt disponerade personer så kan en kombination av ännu oklara miljöfaktorer utlösa en inflammatorisk reaktion som till synes slumpvis och fläckvis angriper nervtrådarnas isolerande hölje, myelinet. Det finns stöd för att den inflammatoriska reaktionen vid MS orsakas av en missriktad immunitet mot myelinet (autoimmunitet). En central cell vid uppkomst av MS är en typ av vita blodkroppar kallade T-lymfocyter. Vissa specifika typer av dessa lymfocyter (CD4+ Th1 celler och CD8+ T-celler) anses särskilt betydelsefulla. En annan vit blodkropp, makrofagen (storätaren), medverkar också, dels som s.k. antigenpresenterande cell, dels genom att lockas till platsen där den medverkar vid nedbrytningen av myelinet runt nervtrådarna. En mycket aktuell och omfattande översikt om dessa mekanismer finns i referens Noseworthy et al 2000.

Fragment av myelin basiskt protein (MBP) kan vara viktigt autoantigen
Kandidater till att vara s.k. autoantigener vid uppkomst av MS är myelin basiskt protein, proteolipid protein och myelin oligodendrocyt glykoprotein (MOG). När MBP bryts ner av de proteolytiska enzymen kymotrypsin och trypsin bildas fragment som är immunogena. Dessa fragment skulle kunna tänkas vara med att starta MS. Som motvikt till de proteolytiska enzymen finns anti-proteolytiska enzym (antiproteaser). Ett vitt spritt sådant med bred specificitet är alfa2-makroglobulin (alfa2-MG).

Den aktuella avhandlingens hypotes
Avhandlingens huvudhypotes är att patienter med MS har ett alfa2-MG som är annorlunda än det hos icke-MS-patienter. Detta alfa2-MG skulle fungera sämre som hämmare av proteolytiska enzymer. Förhöjda värden av olika proteolytiska enzymer (proteaser) har tidigare beskrivits vid MS. Sådana förhöjda värden har visats i MS-plack, MS-myelin och i cerebrospinalvätskan (likvorn). Det finns stöd för att en obalans mellan anti-proteolytiska enzymer och proteolytiska enzymer skulle kunna vara viktigt vid uppkomst av MS. En minskad funktion av anti-proteolytiska enzymer kan ge ökad bildning av proteinfragment som kan fungera som autoantigener. Det anti-proteolytiska enzymet alfa2-MG är ett viktigt försvar mot olika proteolytiska enzymer. Detta enzym har bred specificitet och har visats kunna hämma proteolytiska enzymer av alla fyra huvudklasserna. Alfa2-MG kan också binda flera inflamma-toriska cytokiner som interleukin-1 (IL-1), IL-6, TGFbeta (trans-forming growth factor beta) och TNFalfa (tumörnekrotisk faktor alfa). Alfa2-MG är vitt spritt i kroppen och består av fyra identiska subenheter på vardera 180 kDa.

Metoder i avhandlingen:
I en av huvudstudierna undersöktes de biokemiska egenskaperna hos alfa2-MG hos 4 patienter med MS och jämfördes med alfa2-MG hos friska kontroller. Alfa2-MG renades och lagrades vid -27 grader. Enzymet studerades därefter med polyakrylkamid-elektrofores (PAGE). Man utförde tiolestertitrering med metylamin för att påvisa intakta tiolestrar. Alfa2-MG från MS-patienterna och de friska kontrollerna inkuberades med proteolytiska enzymer för att studera deras kapacitet att hämma dessa enzzymer. Autoradiografi och s.k. isoelektrisk fokusering utfördes också.

Resultat:
Hos 4 patienter med MS påvisades en nedsatt stabilitet av alfa2-MG med en spontan omvandling till en elektroforetiskt snabb form vid rening och lagring. Detta alfa2-MG hade samtidigt en nedsatt förmåga att hämma proteolytiska enzymer. Renat enzym från friska kontroller var däremot stabilt och uppvisade vid elektrofores långsam mobilitet. Vid isoelektrisk fokusering påvisades skillnad i isoelektrisk punkt (pI) hos alla 4 MS-patienterna med två väl åtskilda diffusa band med pI runt 4.7 och 5.8. Alfa2-MG från friska kontroller uppvisade endast ett band med pI runt 4.6.

Proven från MS-patienterna uppvisade dessutom en distinkt s.k. mikroheterogenitet bestående av 6-10 tätt belägna band. Detta är typiskt för varierande glykosylering (påkoppling av sockerämnen) hos proteiner.

Man visade också att den s.k. bait-regionen (krokregionen) hos alfa2-MG var intakt hos MS-patienterna. Detta visar att instabiliteten av enzymerna inte beror på klyvning av proteolytiska enzymer.

Undersökning av tiolestrar hos enzymet visade hos MS-patienterna endast 0.5 titrerbara tiolgrupper per mol jämfört med 4 per mol hos de friska kontrollerna.

Slutsats:
Studierna i avhandlingen visar att alfa2-MG hos MS-patienter är förändrat till sin struktur jämfört med icke-MS-patienter. Bland annat har det en försämrad stabilitet. Detta gör att det fungerar sämre som proteashämmare. Hypotesen är att denna minskade hämning leder till att immunogena proteinfragment uppkommer. Dessa fragment skulle kunna utlösa den autoimmuna reaktionen vid MS.

Kommentar:
Martin Gunnarsson säger till Medical Link att det ännu är oklart hur det förändrade proteinet alfa2-makroglubulin uppkommer. Man vet inte om det är en defekt i själva proteinet, exempelvis en genetisk variation (polymorfism), om det är förändring i glykosylerings-mönstret eller om det är något som orsakas av sjukdomsmönstret. Man har också sett att antalet fungerande tiolestrar är minskat i alfa2-MG som renats från MS-patienter. När man renar proteinet från MS-patienter faller det samman i sin struktur, berättar Martin Gunnarsson. Man har också sett att oxidering av alfa2-MG förändrar dess konfiguration. Ett av de proteiner som kan ge upphov till immunframkallande fragment är myelin-basiskt protein (MBP). Detta protein kan bindas av alfa2-MG. När proteinet klyvts av proteaserna kymotrypsin och trypsin kan dock alfa2MG inte binda de bildade fragmenten.

Inflammatoriska cytokiner som IL-1, IL-6, TGFbeta och inte minst TNFalfa antas medverka i uppkomsten av MS. I detta sammanhang är det intressant att alfa2-MG också kan binda dessa ämnen. Om det förändrade alfa2-MG vid MS även ger nedsatt förmåga att binda dessa cytokiner är ännu oklart. En tidigare studie har visat att ett nytt MS-skov ofta föregås av ökad bildning av TNFalfa i kroppen. I andra sammanhang har man sett att en sådan ökning av TNFalfa kan utlösas av ökat inflöde av endotoxin (lipopolysaccarider) från gramnegativa tarmbakterier. En intressant fråga är om upprätthållande av en normal tarmflora med skyddande probiotiska laktobaciller skulle kunna påverka utlösandet av MS-skov!

Något som också vore intressant att studera är betydelsen av fria radikaler och antioxidantia för uppkomst och/eller utlösande av MS. Martin Gunnarsson har visat att oxidering av alfa2-MG förändrar dess konfiguration. Det finns stöd för att det starkt oxiderande ämnet peroxynitrit kan ha betydelse för uppkomst av MS. Peroxynitrit bildas när kväveoxid (NO) reagerar med den fria syreradikalen superoxid. Relativt få ämnen kan neutralisera peroxynitrit. Hit hör E-vitaminvarianten gamma-tokoferol, hydroxytyrosol (från extra virgin olivolja), glutation (GSH) och glutationperoxidas (GPx).

Referenser:
Gunnarsson M. The conformational complexity of alpha2-macroglobulin and its relation to multiple sclerosis. Thesis. Department of Immunology, Umeå University. 2001.

Gunnarsson M et al. Aberrant forms of alpha(2)-macroglobulin purified from patients with multiple sclerosis. Clin Chim Acta 2000; 295: 27-40.

Gunnarsson M et al. Binding of soluble basic protein to various conformational forms of alpha2-macroglobulin. Arch Biochem Biophys 1998; 359: 192-198.

Haglund O. Multipel skleros (MS) - en sjukdom på väg mot sin lösning? Medical Link 1999-03-12.

Noseworthy JH et al. Multiple sclerosis. New Engl J Med 2000; 343: 938-952.